终于,我们揪出了艰难梭菌在人体内安插的“间谍”

作者:袁鹏飞来源:蝌蚪五线谱发布时间:2018-02-28

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艰难梭菌构成了全球最紧迫的抗生素耐药性威胁。感染艰难梭菌并发病的患者,亟待高效安全的治疗办法。

艰难梭菌(Clostridium difficile),又称难辨梭菌、难辨棱状芽孢杆菌,是一种寄生在哺乳动物(包括人类)肠道中的革兰氏阳性菌。在人类肠道菌群环境正常的情况下,艰难梭菌需要与其它肠道细菌竞争生长,因此也无暇对人类进行任何攻击。这时的它们可以人畜无害地存在着。然而,当人们大量使用抗生素,其它肠道菌群被大量杀害之时,艰难梭菌强大的耐药性可保护他们免受抗生素所害,并迅速占领其它细菌的生存,大量繁殖。无数的艰难梭菌,产生大量毒素分子TcdA和TcdB等毒素分子。这些毒素分子可进入肠道细胞搞破坏,最终引起严重甚至致命性的假膜性结肠炎。

TcdA和TcdB都是蛋白质,如果没有细胞自身分子的接应应该是无法进入细胞内的。那么接应他们的细胞自身间谍分子是谁呢?

大概由于过去的“侦破”技术有限,科学家们只找到了接应TcdA的“间谍”分子,叫做gp96,而目前看来更为可怕的TcdB毒素的“间谍”分子却难以鉴别。

随着技术的发展,终于,我们构建了一种更为强大的“间谍”分子搜索工具,最终揪出了艰难梭菌安插在我们体内,接应TcdB毒素进入细胞的受体蛋白。它的名字叫做CSPG4。

主要“间谍”分子搜索工具介绍

1. shRNA文库

使用shRNA文库对细胞表达分子进行筛选,可快速锁定嫌疑分子。

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是自然界中普遍存在的一种现象,发生在基因转录后,蛋白翻译前的mRNA阶段。RNAi具体是指,真核细胞内,由双链RNA引起的,针对包含特定序列的基因产物表达量下调,或称“基因沉默(Gene Silencing)”。

除了外源导入的小双链RNA(Small Interfering RNA,siRNA)可以在真核细胞内引发基因沉默以外,哺乳动物细胞中还存在着一种天然的RNAi机制,作为调控基因表达的一个方式。这种RNAi由microRNA介导,microRNA由染色体上一些特殊的区域产生,这些区域产生的RNA并不转录为蛋白质,且存在发卡结构。它们由二型RNA聚合酶转录产生,刚刚转录出来的RNA(primary microRNA transcripts,pri-miRNAs)在细胞核内首先经Drosha–DGCR8 (DiGeorge syndrome critical region gene 8)复合物处理,产生microRNA前体(precursor miRNAs , pre-miRNAs),pre-miRNAs从核孔中进入到细胞质内,此时的pre-miRNAs也被称为小发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)在这里,shRNA会和Dicer–TRBP–PACT复合物结合,接受进一步的处理,剪掉环状结构,仅留下双链RNA。在细胞质内,双链RNA会召集包括AGO2在内的一系列蛋白,形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex,RISC),通过双链RNA中有义链的序列,特异性的识别并降解靶序列mRNA,造成基因的蛋白质产物减少,基因沉默(Lord et al., 2009)。

在充分了解了RNAi的机制的基础上,人们可以通过外源导入各种双链RNA或者能够产生microRNA的DNA,在细胞内模拟整个RNAi的发生过程,特异性的抑制某基因的表达水平。在哺乳动物细胞中广泛采用的方式,模拟的是体内microRNA的生成途径。这种方法将编码microRNA类似物的DNA序列导入细胞中,在细胞内,这些DNA的转录产物为shRNA(图2.10 e)或更早期的pre-miRNAs(图2.10 f),最终生成双链RNA发挥作用。由于DNA相比于RNA更加稳定,同时有机会整合到基因组中,因此这种方法可以在长时间内保持稳定的RNAi效果(图2.10 e)(Echeverri et al., 2006)。为了达到高效稳定的RNAi效果,目前普遍采用的是将shRNA与慢病毒载体(lentiviral vectors)结合起来,通过慢病毒载体将序列整合到染色体上,模拟整个microRNA在体内成熟的全过程,实现性状的稳定。

基于RNAi技术的基因功能缺失型筛选,从策略上来说,可以分为分离型筛选方法(separated library screening)和混合型筛选方法(pooled library screening)。分离型筛选方法将针对不同基因的RNA试剂分装于多孔板(通常是96孔或384孔板)中,以多孔板为最终解码的基础,即通过产生强烈表型的孔来判断相应的RNAi试剂,再进一步推测出相对应的基因。而混合型筛选方法则是预先将RNAi试剂混合在一起,将试剂转入细胞后,通过表型将符合预期的细胞分离出来,下一步通过测序、microArray等手段解码出对应的基因。

随着测序技术的不断发展,尤其是二代测序(Next generation sequencing, NGS)的出现,混合型文库筛选的后期的解码工作质量有了很大的提升。通过NGS,科研工作者可以通过单个PCR,一次测序即可获得整个筛选的结果,与此同时,NGS提供的大量数据信息能够很好的保证数据的可靠性。

故本研究采用第二代慢病毒系统包装shRNA文库,转染Hela细胞,接受TcdB处理,设置对照组与实验组,筛选富集出对TcdB有抗性的细胞,分别提取经处理后保留下来的HeLa shRNAmir文库细胞,以及未经处理的对照组细胞的基因组DNA,通过PCR的方式扩增出shRNA信息,并通过深度测序的方式进行深度解码。shRNA文库筛选为我们提供了关于艰难梭菌毒素B在细胞内发挥毒性过程中宿主细胞的大量信息,如何迅速的对这些信息进行验证,准确的排除假阳性结果,是后续实验的关键。我们在该结果中发现了一个非常有趣的现象,即针对基因CSPG4的两条不同的shRNA,均出现在了高度富集的shRNA中

2. 基因编辑方法——TALE

使用基因编辑方法——TALE,为“嫌疑”分子验明正身,精确度极高。

目前研究流域存在三种主流基因编辑方法。锌指蛋白酶(Zinc-nger nucleases, ZFNs),转录激活类似因子核酸酶(Transcription activator like effector (TALE) nucleases, TALENs)以及,CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated)系统。

ZFNs与TALENs定点识别染色体的机制均是通过蛋白质实现的。其中锌指是一类含有锌离子以稳定构象的较小蛋白结构,每个锌指可以稳定折叠成“手指”状,识别有一定特异性的3bp DNA序列,以此为基础,多个锌指蛋白串联在一起,即实现了对于长片段DNA的特异性识别。TALENs的原理与ZFNs不同,具体原理由下一节阐述。在拥有通过蛋白质特异识别DNA的能力后,科研工作者在其后加上了一个核酸酶结构FokI,由于FokI只有形成二体才能工作,所以ZFNs与TALENs均需要一对才能发挥作用(如图2.14所示)。这种设计方式主要是为了保证更好地特异性,防止“误伤”。与ZFNs和TALENs不同,CRISPR/Cas对特定序列的识别,是通过DNA/RNA之间互补配对实现的。现在广泛使用的是第二类CRISPR系统, Cas9蛋白以小导向RNA(small guide RNA, sgRNA)以及PAM(protospacer-adjacent motif)特异性的识别DNA序列,当结合完毕后,Cas9/sgRNA复合体会特异性的激活核酸酶活性,切断染色体DNA,造成双链断裂。与ZFNs和TALENs相比,CRISPR/Cas的优势明显。因为该系统识别切割DNA的原理是通过碱基互补配对的方式,这种结合方式简单高效,不需要复杂的设计;且RNA只需简单的合成或DNA转录即可得到,不需要复杂的蛋白质工程操作。

但是CRISPR/Cas系统也有不足之处,它的识别取决于PAM序列,不能随意设计定点突变和缺失,而TALENs则可以按需设计断裂任意目的基因,可以工程化的定制结合任意序列的TALE蛋白,故本研究采用TALENs方式建立强大而高效的筛选系统。

我们首先利用密码子的简并性原理,设计出四种能够翻译成TALE蛋白重复区域的DNA片段,分别命名为W、X、Y和Z,使得重复序列在DNA水平上有所不同。我们将四种结构与四种RVD进行组合,共产生了12个可供选择的TALE蛋白重复区域单体。通过ULtiMATE方法,我们共构建出340条能够结合特定DNA序列的TALEN质粒。这套方法成本低廉,耗时少,菌落PCR阳性率较高。在HeLa细胞中,其在染色体水平介导基因组编辑的效率为64.63%,在HEK293T中为57.23%。在细胞水平,基因敲除的概率为,HeLa细胞18%,HEK293T细胞22%。

CSPG4发现及鉴定过程总结:

我们首先使用shRNA文库对细胞所表达的分子进行筛选,结果发发现有两条不同,但均指向CSPG4的shRNA同时得到了很高程度的富集;利用TALEN和CRISPR技术,我们在HeLa以及HT293细胞中实现了CSPG4基因敲除,进一步发现CSPG4的缺失显著的提高了两种细胞系对于TcdB的抗性;通过流式细胞术以及免疫荧光等技术手段,我们发现CSPG4直接影响TcdB在细胞表面的结合以及内吞;通过Co-IP实验,我们确定了CSPG4与TcdB之间存在相互作用,并进一步鉴定出了CSPG4第401至560位氨基酸(CSPG4-N401-560)是与TcdB相互作用的区域。我们分离纯化了CSPG4-N401-560肽段,通过pull-down实验我们发现CSPG4与TcdB存在直接相互作用,且外加该肽段能显著抑制TcdB对于细胞的毒性。与此同时,我们通过腹腔注射的方式,对比了NG2(CSPG4在小鼠中的同源蛋白)缺失型小鼠与野生型小鼠对于TcdB的反应,结果显示,在IL-8这一艰难梭菌感染中重要的炎症指标上,NG2缺失型小鼠显著低于野生型小鼠。

通过体外和体内实验,我们证明了CSPG4能够通过与TcdB直接相互作用介导TcdB的入胞,CSPG4是TcdB的细胞受体。CSPG4的发现,为我们理解艰难梭菌感染的分子机制提供了新的角度,也为治疗艰难梭菌感染提供了新的靶点。

艰难梭菌小档案:

艰难梭菌(Clostridium difficile),又称难辨梭菌、难辨棱状芽孢杆菌,是一种寄生在哺乳动物(包括人类)肠道中的革兰氏阳性菌。艰难梭菌严格厌氧,于1935年首次分离培养得到。艰难梭菌感染能够引起不同程度的腹泻,其中一些比较严重的情形,如伪膜性肠炎(pseudomembranous colitis, PMC),1893年就曾被记录过,但直到1978年,这些腹泻症状才和艰难梭菌联系起来(George et al., 1978; Bartlett , 1994)。

艰难梭菌感染是经抗生素治疗后引起传染性腹泻的最主要原因。艰难梭菌能产生在体外有很强生存能力的孢子,这些孢子有相当的概率存在于医院等医疗机构,并会感染住院患者以及医疗工作者。与此同时,艰难梭菌对抗生素有较强的耐药性,虽然在正常的肠道菌群中,少量存在的艰难梭菌不会产生明显的病理性症状,但经抗生素治疗后,正常的肠道菌群被抗生素破坏,艰难梭菌变为优势种群,大量增长,随即会引起腹部疼痛、腹泻以及发热,典型的症状包括伪膜性肠炎,以及更为严重的巨肠症、肠穿孔以及败血症等,直至死亡(Voth et al., 2005; Rupnik et al., 2009)。艰难梭菌感染的症状主要集中在肠道,较少有肠道外的伤害。

艰难梭菌感染产生的伤害是通过其分泌的两种蛋白质毒素介导的(Thelestam et al., 2000; Rupnik et al., 2006; Jank et al., 2007)。毒素A(TcdA)和毒素B(TcdB)具有相似的结构,同属于巨大梭菌毒素家族(Large clostridial toxin, LCT)。两种毒素在细胞内有相似的作用机制,均通过糖基化宿主细胞(肠细胞)内Rho蛋白家族成员,使其失活,进一步造成肠细胞骨架丧失,肠道上皮结构破坏,并引起强烈的炎症反应,引发腹部疼痛,腹泻等症状(Riegler et al., 1995; Thelestam et al., 2000; Rupnik et al., 2006)。对于TcdA和TcdB在艰难梭菌感染中发挥的作用,相关领域内一直存在争议,但通过艰难梭菌仓鼠感染模型,领域内逐渐认同TcdB是发病过程中所必须的毒素因子,而TcdA的角色依然需要继续研究(Heap et al., 2007; Lyras et al., 2009; Kuehne et al., 2010)。

TcdA和TcdB均是通过受体介导的内吞途径进入细胞(Voth et al., 2005)。作为艰难梭菌毒素入侵细胞的第一步,受体在引导TcdA、TcdB入胞过程中起着至关重要的作用。GP96被认为是TcdA的受体或者辅受体(Na et al., 2008),但在我们之前,人们对于TcdB的受体一无所知。

对感染性疾病的研究,很长一段时间内都集中在病原体上。这些研究通过对病原体生长、繁殖、致病等多个过程的探索,然后特异性的阻断其中一个或几个过程,从而起到消灭病原体,治愈疾病的目的。这种研究方式对于治疗感染性疾病,保护人类健康无疑起到了特别重要的作用。但随着抗生素药物、抗病毒药物的广泛使用,致病微生物也逐渐产生了抗性。因此,从宿主角度研究感染性疾病致病过程中的关键因子,理解感染性疾病发病的机制,在提供新的药物靶点,提供治疗疾病新思路的同时,也能在很大程度上缓解致病微生物对于药物的耐受性问题。

艰难梭菌感染作为一种世界范围内的感染性疾病,对于人类健康有很大危害。根据美国疾病控制与预防中心2013年发布的报告,仅在美国一地,每年即有超过250,000人感染艰难梭菌并发病,其中14,000人因此死亡。每年因此导致的医疗花费超过10亿美元(U.S. Department of Health and Human Servces,2013)。在具有高传染性,高复发率以及低治愈率的同时,艰难梭菌还具有非常强的抗生素耐药性,因此,从宿主角度理解艰难梭菌的发病机制,对于预防以及治疗艰难梭菌感染,更有着特别的意义。

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