细胞自噬在病毒复制中的作用

作者:侯磊来源:蝌蚪五线谱发布时间:2018-02-28

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自噬(autophagy)这个名词的来源

20世纪50年代中期,科学家在研究过程中观察到细胞里存在着一个新的“小隔间”(这种小隔间的学名称为细胞器),这种细胞器包含着很多酶,它们可以消化蛋白质、碳水化合物和脂质。这个小隔间后来被称作“溶酶体”,是细胞在生命活动中用来降解细胞组分的工作站。60年代的观察表明,在溶酶体内部含有大量的细胞内部物质,甚至包含有整个的细胞器。通过进一步的生化和显微分析发现,有一种新型的单层或双层囊泡负责运输细胞组分进入溶酶体进行降解。

发现溶酶体的比利时科学家克里斯汀·德·迪夫(Christian de Duve),创造了自噬这个名词来描述细胞中的这一过程。将这种新的囊泡被命名为自噬体。细胞中的自噬体在形成过程中,逐渐包裹和吞没胞质中的内容物,例如受损的细胞器、未折叠的蛋白质等,随后自噬体与溶酶体融合,其中的内容物被溶酶体内的酶降解成更小的物质成分,这一过程为细胞提供了自我更新和循环利用的营养物质或被清除细胞体外。克里斯汀·德·迪夫于1974年因发现溶酶体和过氧化物酶体而被授予诺贝尔生理学或医学奖。

自噬的突破和进展  

虽然人们逐渐知道了细胞自噬的存在,但是只有在2016年诺贝尔生理学或医学奖得主大隅良典的精巧试验之后,人们才意识到自噬的机制,懂得它的重要性。科学家大隅良典主要研究酵母的生存机制,液泡是酵母中的一种细胞器,它的功能和人体中溶酶体的功能类似。酵母细胞相对更容易进行研究,因而常被用作人类细胞的模型。他起初都无法确定自噬现象是否也会发生在酵母细胞中,但是他通过阻断液泡中蛋白质降解的过程来观察自噬的发生,显微镜下发现阻断降解后导致液泡中自噬体的累积。因此,他培育出因突变而缺乏液泡降解酶的酵母细胞,并通过使细胞饥饿去诱导自噬。在他发现酵母自噬一年内,大隅良典就鉴定出了第一批对自噬至关重要的基因,并对这些基因所编码的蛋白质的功能进行了研究。

细胞自噬是吃什么?

在酵母自噬的机制被逐渐研究深入后,研究者们就不断的提出一个关键问题,其他的生物里有没有自噬的存在?有何种对应的机制来控制自噬过程呢?很快人们发现,哺乳动物细胞里也有几乎一样的机制在运行。

第一种情况是吃外来物。当一些外来的感染性物质进入细胞后,细胞启动自噬机制,清除异物。

第二种情况是吃自己的成分(自我修复)。细胞在生命活动之,会不断产生大量的废物,致使细胞活动受到影响。此时,细胞自噬被启动,将积累在细胞质中的代谢产物(多为蛋白质)或受损的细胞器降解并清除,其中一部分降解产物可被细胞再利用作为细胞生命活动的原料。以上这两种情况均是细胞的自律情况,能防止细胞的非正常死亡。

第三种情况是自噬会不停歇的吃自己的成分,直至细胞死亡。这种情况也是细胞自我保护的一种非正常现象。由于细胞中多余的蛋白质或破损的细胞器超过细胞自噬修复的能力后,机体为了维持自身的正常运转,就会启动一种细胞死亡途径(细胞凋亡),清除受损的细胞。

细胞自噬的过程和检测方法

细胞自噬的发生过程大致分为三个阶段:诱导阶段、成熟阶段和降解阶段。诱导阶段中,细胞在自噬刺激信号(如饥饿、环境应激或病原微生物感染等)的诱导作用下,胞浆中开始出现大量的杯状或新月形的分隔膜;成熟阶段中,分隔膜不断延伸将胞浆内待降解的生物大分子或受损细胞器包裹,形成双层膜的囊泡结构,即自噬体;降解阶段中,待自噬体成熟后,自噬体育溶酶体融合形成自噬溶酶体,包裹的内容物被溶酶体内的酶进行降解并被细胞再利用(下图)。


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细胞自噬的检测方法主要有三种:1、透射电子显微镜技术:观察胞浆中出现的包裹有待降解内容物或受损细胞器的双层或单层膜泡状结构(分别为自噬体和自噬溶酶体);2、免疫印迹技术:检测自噬标志分子LC3-Ⅰ蛋白向LC3-Ⅱ蛋白的转化,用以分析细胞自噬活性的程度;3、激光共聚焦免疫荧光技术:观察自噬活性增强情况下胞浆中LC3蛋白染色信号的点状分布情况。

细胞自噬与病毒感染间的相互作用关系

病毒作为专性的细胞内寄生物,它的生存与拮抗宿主细胞抗病毒防御机制的能力密切相关。越来越多的研究表明,细胞自噬在不同病毒感染过程中的作用不尽相同。主要分为三种作用方式:第一种是细胞自噬抑制病毒复制,以Shelly等人的研究结果为例,研究发现细胞自噬能够保护果蝇抵抗水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV)的感染;抑制成年果蝇体内或培养的果蝇细胞内的自噬活性可以增强 VSV的复制;第二种是细胞自噬促进病毒复制,例如微RNA病毒科中的脊髓灰质炎病毒、肠道病毒、脑心肌炎病毒,副粘病毒科中的人的3型副流感病毒和黄病毒科中丙肝病毒均能诱导宿主细胞 产生自噬体样的泡状结构,并且病毒可借助这些模型结构进行复制;第三种是细胞自噬与病毒复制间无直接关系,研究发现都病毒科中痘苗病毒的复制与细胞自噬无关。

禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV),又名火鸡鼻气管炎病毒(Turkey rhinotracheitis virus,TRTV)、禽鼻气管炎病毒(Avian rhinotracheitis virus,ART)或禽肺病毒(Avian pneumovirus,APV),是一种世界范围内分布的禽类重要病原,主要引起火鸡和鸡的上呼吸道系统疾病。鉴于以上关于病毒与自噬相互作用关系的研究报道,那么对于我们课题组分离的C亚型禽偏肺病毒(aMPV/C)来说,它与细胞自噬间又是何种互作关系呢?针对这一问题,侯磊设计并开展了相关研究内容:首先研究病毒感染过程中细胞自噬的活化情况;其次分析细胞自噬与病毒复制件的相互作用关系;最后研究参与细胞自噬的信号通路情况。我们首先利用免疫电镜技术观察到aMPV/C感染的细胞中出现数量较对照组细胞中多的双层或单层囊泡结构,随后又利用免疫电镜技术观察到病毒蛋白或疑似的病毒颗粒附着在囊泡周围;通过免疫印迹技术分析细胞自噬活性时,我们将病毒感染不同细胞,发现病毒感染组细胞中LC3-Ⅰ蛋白向LC3-Ⅱ蛋白的转化程度高于对照组细胞,并观察到病毒蛋白与LC3蛋白以共定位形式出现在细胞胞浆中;进一步将病毒灭活后在感染细胞,发现灭活病毒并不能明显诱导LC3蛋白的转化;这些结果表明aMPV/C感染可诱导细胞自噬,且细胞自噬的发生与病毒复制有关。在证实aMPV/C感染诱导细胞自噬的基础上,分别利用自噬调节剂和 siRNAs 人工改变宿主细胞的自噬活性后再感染aMPV/C,然后通过免疫印迹技术和TCID50试验检测细胞自噬对aMPV/C复制的影响。结果表明细胞自噬可促进aMPV/C的复制。近期研究报道发现内质网应激(ER stress)通路的激活可诱导细胞自噬的发生,而内质网应激通路包括PERK通路、IRE1通路和ATF6通路,为了弄清aMPV/C诱导的细胞自噬是否与ER stress活化有关或与哪一条通路有关,我们将毒胡萝卜素(Tg)处理组作为内质网应激活化的阳性对照组,分析aMPV/C感染激活ER stress的情况,研究发现,aMPV/C感染仅激活了ATF6通路;随后我们将同属副粘病毒科的新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)作为一个病毒对照进行分析,发现NDV诱导PERK通路和ATF6通路,这一结果的差异也是我们研究的创新之处,发现了aMPV/C诱导细胞自噬的不同分子机制,结果说明ATF6通路在aMPV/C诱导的细胞自噬过程中起重要作用。

对未来禽偏肺病毒分子致病机制研究的影响

禽偏肺病毒在鸡群中的普遍存在以及感染后引起的继发感染给养禽业造成严重的经济损失,但其分子致病机制尚不清楚。本研究从细胞自噬角度出发,研究C亚型禽偏肺病毒在宿主细胞中复制的分子机制,通过进一步研究病毒诱导细胞自噬的信号通路情况,发现同属副粘病毒科的禽偏肺病毒和新城疫病毒在细胞自噬的诱导机制上存在差异,揭示了禽偏肺病毒利用细胞自噬利于自身复制的独特分子调控机制。通过阐明细胞自噬在C亚型禽偏肺病毒感染过程中的分子机制不仅对深入分析和比较不同亚型禽偏肺病毒在诱导机制中的差异,对研究细胞自噬与细胞凋亡、细胞自噬与天然免疫反应和细胞自噬与炎症反应间相互作用关系提供了更多的科学依据和理论基础。

本人所在实验室为北京市畜禽疫病防控技术重点实验室,实验室近年来主要从事动物病毒的分子生物学、感染与免疫等方面研究,并已具备从事相关研究所需要的实验仪器设备和条件。上述的研究成果是在刘爵研究员的指导下,韦莉、朱珊珊、王菁、全荣、李子璇、阎旭、杨嘉玉、刘超等实验室同事及学生的支持和帮助下顺利完成的,感谢我们这个团结、向上、年轻的研究团队。

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